chinallergy@163.com 400 - 8049 - 899 ; 027-65022780

Working Hours : Mon-Fri : 09:00-18:00

分子克隆

表达系统

服务编号服务项目服务标准价格周期
3201TA克隆 需要连接的目的片段≤600bp,克隆到T载体并进行测序¥4002周
3202基因克隆目的基因大小≤1000bp,包括从组织或细胞中调取目的基因、克隆到T载体并进行测序¥30003-4周
3203亚克隆目的基因≤1000bp,酶切后克隆到指定载体¥10001-2周
3204定点突变根据客户需要,一般需要突变的位点≤3个,多个请询价¥1700-20002-3周
3205普通PCR根据客户要求,提供从引物合成、到PCR扩增,最后电泳检测目的条带的一站式服务¥100/样2周
3206DNA测序根据客户的需要,提供对PCR产物、菌样、重组载体等DNA序列的测定¥28/反应3-5天
3207引物合成根据客户提供的引物序列进行合成,15-60bp,2OD¥1.5/bp3-5天
3208全基因人工合成目的基因在200-3000bp之间的,合成后基因克隆于常用载体¥3.5/bp3-4周
3209质粒载体改造根据客户需要,提供包括载体MCS改造,启动子、增强子、筛选标志物等功能元件的改造等,使得经过改造了的载体满足试验研究的需求。询价5-6周
3210cDNA文库构建提供从以mRNA为模板体外反转录生成cDNA,到连接载体转化受体菌,并繁殖扩增形成包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合的全套实验服务120004周

TA克隆(TA Cloning)

定义

把PCR片断与一个具有3-T突出的载体DNA连接起来的方法。因为PCR反应中所适用的聚合酶具有末端转移的活性,通常在3'端加上A。例如:Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能,PCR反应时在每条PCR扩增产物的3'端自动添加一个3-A突出端。只有用经过特殊处理的具有3-T突出末端的DNA片断才能通过T/A配对进行连接。

通过PCR的方法扩增目的基因片断的过程中,由于往往不清楚目的基因的DNA序列,获得的目的片断通常需要通过TA克隆的方法,重组到T-载体中,通过序列测定清楚DNA序列。由于在PCR过程中,使用的DNA聚合酶不同,往往分为2种情况:(1)使用不同的Taq酶,在PCR扩增循环结束后,加上72℃ 10分钟一个过程,Taq酶可以在扩增产物的3末端加上A,因此PCR产物回收纯化后可以和T载体直接连接。(2)使用高保真的DNA聚合酶,如pfu酶,由于其不能在扩增产物的3末端加上A,得到的DNA序列为钝端,因此,需要在回收纯化后进行加A的过程,通常是以PCR回收产物为模板,加上一定量的普通Taq酶和反应液,加入dATP(或dNTP),72℃10分钟,然后将加A产物直接用于TA连接。

实验材料要求

(1)未纯化的PCR产物及PCR电泳图片

(2)PCR扩增引物序列

(3)PCR扩增用酶如果使用含3'→5'外切酶活性的聚合酶,请提供PCR引物,我们将重新扩增PCR产物以保证能行TA 克隆操作。

服务说明

(1)PCR产物TA克隆实验中,PCR片段越大,TA克隆难度越大。

(2)TA克隆实验中,我们使用的是大家常用T载体作为标准T载体,如果对载体有特殊要求,请再实验之前告知客户服务人员。

终产品

提供一份冻干后的送测质粒,相应测序结果及穿刺菌,pMD18-T载体图谱和序列,TA克隆实验报告

基因克隆(Gene Clone)

定义

基因克隆是指在体外将含有目的基因或其它有意义的DNA片段同能够自我复制的载体DNA连接,然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程,又称为基因操作或重组DNA技术。基因克隆涉及一系列的分子生物学技术,如目的DNA片段的获得、载体的选择、各种工具酶的选用、体外重组、导入宿主细胞技术和重组子筛选技术等等。

基因克隆的一般流程

(1)目的片段和载体的制备(从组织或细胞中提取基因)

(2)目的片段和载体的连接

(3)连接产物的转化

(4)重组子的筛选

(5)测序鉴定

服务内容

(1)以质粒、基因组DNA、cDNA、PCR产物等为模板PCR扩增目的基因。

(2)PCR产物TA克隆

(3)重组质粒测序。

服务说明

(1)本公司可以免费提供TA克隆载体,如需要特殊载体请您自己提供。

(2)设计PCR扩增引物时如需引入酶切位点,请提前告知。

终产品

(1)克隆构建的质粒及含有该质粒的菌种;

(2)完整实验报告(包括具体实验步骤、照片等)。

(3)测序彩色波形图、序列碱基图、酶切位点图。

亚克隆(subclone)

产品定义

亚克隆就是对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆,其目的在于对目的DNA进行进一步分析,或者进行重组改造等。

亚克隆的一般流程

(1)目的DNA片段和载体的制备(目的基因从另外的基因大片段或质粒载体中获得);

(2)目的DNA片段和载体的连接;

(3)连接产物的转化

(4)重组子筛选

服务内容

(1)将含有目的基因的质粒采用双酶切的方法克隆至商品化的表达载体或改造后的特殊载体上。

(2)将载体上的目的基因进行PCR扩增并加入酶切位点后,克隆至商品化的表达载体或改造后的特殊载体上。

(3)利用PCR、酶切等手段对已有载体进行改造。

服务说明

送样时,请注意:

(1)原始模板信息:序列名称、载体名称、载体抗性、插入片段大小、是否对需要亚克隆的序列进行测序(若已测序,请提供测序报告;若未测序,需另加收测序费用)。

(2)亚克隆方式:5’ 酶切位点信息、3’ 酶切位点信息、目的载体信息(名称、抗性、大小、是否经过改造)。如果目的载体经过改造,请提供改造后的全序列以及测序峰图;或至少提供插入位点上下游各500bp以上的测序报告。

(3)目的序列信息:两端加好酶切位点的目的序列。

终产品

(1)克隆构建的质粒及含有该质粒的菌种;

(2)完整实验报告(包括具体实验步骤、照片)等;

(3)分析报告、测序图谱、质粒构建图、序列比对文件。

定点突变

定义

通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目的DNA片段(可以是基因组,也可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化),包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征,是基因研究工作中一种非常有用的手段。

一般实验流程

(1)对待突变基因测序结果进行分析,设计突变方案;

(2)根据突变方案设计合成覆盖突变位点的双向引物,合成目的DNA两端引物,进行高保真PCR反应;

(3)默认情况下,将PCR产物克隆至T载,或者根据要求亚克隆至目的载体;DNA测序验证突变序列的正确性。

服务要求

(1)我们会对需要突变的质粒进行测序验证,以确保与您提供的原始序列真实一致,如果客户已经测序验证过,请提供测序峰图文件。

(2)在不涉及研究课题隐私的情况下,请尽量提供待突变的质粒图谱,便于我们设计实验定点突变实验方案。

(3)定点突变一般须有含有待突变基因的高纯度质粒,不少于10μg,电泳图清晰,达酶切及测序要求。

服务说明

从修复突变的操作层面来说,相邻10个碱基以内的两个突变,可以在一次修复实验中完成,因此只收取一次费用,客户需要提供含有目的基因的质粒或菌液,原始质粒的测序图谱,突变后序列及载体信息的相关资料。

终产品

(1)QC报告单一份。

(2)含目的基因的质粒。

(3)含有突变后的菌株。

(4)突变后质粒的测序图谱。

PCR

定义

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction),简称PCR,是一种分子生物学技术,用于扩增特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。

PCR技术类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

一般实验流程

(1)预变性:模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要,建议加热时间参考试剂说明书,一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。

(2)变性:循环中一般95℃,30秒足以使各种靶DNA序列完全变性,可能的情况下可缩短该步骤时间,变性时间过长损害酶活性,过短靶序列变性不彻底,易造成扩增失败。

(3)引物退火:退火温度需要从多方面去决定,退火温度对PCR的特异性有较大影响。

(4)引物延伸:引物延伸一般在72℃进行(Taq酶最适温度)。

(5)循环数:大多数PCR含25-35循环,过多易产生非特异扩增。

(6)最后延伸:在最后一个循环后,反应在72℃维持10-30分钟,使引物延伸完全,并使单链产物退火成双链。

服务内容

以cDNA、质粒、基因组DNA 、 PCR 产物等为模板PCR扩增目的片段。

样品要求

(1)客户提供模板:cDNA(>15μl),基因组DNA(>1μg),质粒(>100ng),PCR产物(>1μg)

(2)引物:包括上游和下游引物(> 0.2OD),客户可以自行提供,也可以交由我们设计合成

服务说明

请在实验前说明PCR扩增产物的用途,如需扩增特殊的目的片段,请与我们联系。

终产品

(1)PCR 扩增产物;

(2)琼脂糖凝胶电泳图片;

(3)完整实验报告;

DNA测序

定义

DNA测序是重要的分子生物学分析方法之一,它不仅为基因表达、基因调控等生物学基础研究提供重要数据,而且也在疾病诊断学、基因治疗等应用研究中起着重要的作用。

一般实验过程及原理

1. 化学法:Maxam-Gilbert化学修饰法

基本原理 :用化学试剂 处理具有末端放射性标记的DNA片段 ,造成碱基的特异性切割并产生一组具有不同长度的DNA链降解产物,经凝胶电泳分离和放射自显影后,可直接读出待测DNA片段的核苷酸序列。

优点:不存在因DNA序列或结构引起DNA合成问题,能测定用酶学方法不能正常测序的DNA序列。

缺点:需使用剧毒化学试剂。

2. 生化方法:Sanger的双脱氧链终止法

基本原理:在DNA的合成过程中加入双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP在脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基,不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键,因而形成一种全部具有相同5’-引物端和以相应ddNTP残基为3’端的长短不一的一系列混合物,经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离制得的放射性自显影区带图谱将为新合成的不同长度的DNA链中相应碱基的分布提供准确信息,从而读出DNA的序列。

测序样品说明

1、菌种

请提供新鲜的菌液或平板,4℃保存,时间不超过3天;菌液的沉淀菌体体积大于30ul。注明抗性,每个样品所用的载体,插入片段大小,测序的引物名称,单向或双向测序。

2、PCR产物

请提供特异性扩增的产物和特异测序引物并附带相应胶图,PCR产物大小不低于100bp,浓度不低于30ng/ul,体积大于20ul;特异引物浓度不小于5pmol/ul,每个反应提供5ul。由于纯化方法不同,对测序结果影响较大,故建议提供未纯化PCR产物。产物中不得含有任何染料等有颜色的物质。

3、纯化质粒

请标明质粒纯化方法,浓度不低于100ng/ul,体积大于15ul,每个样品所用的载体,要求测序的引物名称,单向或双向测序,插入片段大小。因为纯化方法不同,可能影响测序质量(酚、氯仿抽提的样品不适于测序),故建议提供菌液。

引物要求

1、PAGE纯化;

2、浓度大于3umol/l,体积大于20ul;

3、随机引物和兼并引物不适合测序;

4、尽可能提供引物全序列,PCR退火温度;

5、订单上注明的通用引物我公司可免费提供。

我们可提供的通用引物:T3、T7、T7 term.rev、SP6、M13F、M13R、M13F(47)、M13R(48)、M13(-96)等

引物合成

定义

引物(primer),是一小段单链DNA或RNA,作为DNA复制的起始点,在核酸合成反应时,作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链,在引物的3′-OH上,核苷酸以二酯链形式进行合成,因此引物的3′-OH,必须是游离的。 引物合成是通过测定引物的OD值,溶解引物,最终合成引物的一个完善的过程。

原理

目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。亚磷酰胺三酯法合成DNA片段,具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的,合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的,相邻的核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接。

一般实验流程

1、将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应,脱去其5′-羟基的保护基团DMT,获得游离的5′-羟基。

2、合成DNA的原料,亚磷酰胺保护核苷酸单体,与活化剂四氮唑混合,得到核苷亚磷酸活化中间体,它的3′端被活化,5′-羟基仍然被DMT保护,与溶液中游离的5′-羟基发生缩合反应。

3、带帽(capping)反应,缩合反应中可能有极少数5′-羟基没有参加反应(少于2%),用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应,这种短片段可以在纯化时分离掉。

4、在氧化剂碘的作用下,亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。

5、经过以上四个步骤,一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5′-羟基上的保护基团DMT,重复以上步骤,直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。通过氨水高温处理,连接在CPG上的引物被切下来,通过OPC, PAGE等手段纯化引物,成品引物用C18浓缩,脱盐,沉淀。沉淀后的引物用水悬浮,测定OD260定量。

服务特色

1、合成仪机型:Dr.Oligo-192、ABI3900、MerMade192 ;

2、为保证引物的质量,本公司销售经过 PAGE 和 OPC 柱两种方式纯化的引物。

3、发货时间:常规引物在两个工作日以内、非常规的修饰引物在五个工作日以内;

4、可完成多种类型的引物修饰及标记。

服务说明

1、如客户未注明合成规模,普通引物我们将按2OD的量合成

2、修饰或标记引物的价格计算方式是:常规引物的价格加上修饰或标记的价格;

全基因人工合成

定义

基因是具有特定生物学功能的核苷酸序列,如果采用一般的实验手段无法得到目的基因时,可以进行实验室的人工合成。该技术的核心内容是以化学和生物学方法合成,包括自然界不存在的基因、人工改造基因以及自然界存在但难以用常规方法获取的基因。

基因的人工合成就是指用有机化学合成和酶促合成的方法,使单核苷酸通过3',5’磷酸二脂键连接成寡核苷酸,多核昔酸和具有生物活性的完整的核酸分子。基因的人工合成,除基因的克隆化以外的获得目的基因的又一种重要方法。基因的人工合成与基因的克隆化,PCR扩增等方法不同,不需目的基因的DNA或mRNA 作为转录和逆转录的模板,只是根据目的基因的特定碱基序列的信息和排列方式。目的基因,持别是较短的目的基因的片段,以人工合成的方法更经济、更简便。

服务特色

1、经验丰富,对于复杂基因,如:重复序列、高GC、发夹等富含特殊结构的基因合成,也有丰富经验。

2、质量可靠, 我们3730测序仪测序,提供测序的彩图文件,以保证所合成的基因序列100%的准确。

3、性价比高,与同标准的基因合成服务相比,价格低廉,并提供的免费基因设计包括酶切位点设计、密码子优化和克隆方案的制定等服务的相关咨询。

4、严格保密,公司承诺不扩散、不利用、不开发所合成的基因,忠实守信,确保您的基因安全,保证您的知识产权等相关权益。

服务流程

1、提供您所需要合成的基因序列。

2、专业人员对您提供的序列进行可行性分析,依据后期实验目的,进行序列优化,设计基因合成方案。

3、设计引物,开始合成,最终测序验证序列的准确性。

终产品

1、基因合成报告单一份

2、含目的基因的质粒一份

3、含目的基因的菌株一份

4、基因合成的测序图谱一份

质粒载体改造

定义

DNA片段的克隆需要合适的载体,载体或是质粒,或是噬菌体,或是病毒,通常大多经过人工改造。作为载体必须具备两条件:一是该载体在细胞内必须能自主复制,即必须具备复制原点;二是该载体必须具备适合的酶切位点,且这些酶切位点不在复制原点区域内。以上两条,保证了载体的可繁殖性和可利用性。为了便于获得阳隆克隆,载体上常有筛选标记,如对抗菌素的抗性,某些基因产物的显色反应等。

服务说明

1、如载体由客户提供,则客户需要提供足量高纯度的质粒(>5ug,电泳图清晰,达酶切测序要求)及本公司鉴定工作所需的材料。

2、客户应保证所提供原材料即基因模板的正确性。如基因模板本身具有移码突变或其它无义碱基突变,由此造成的实验时间延误、重复实验费用或其它经济损失均由客户承担

终产品

1、克隆构建的质粒及含有该质粒的菌种;

2、完整实验报告(包括具体实验步骤、照片)等;

3、分析报告、测序图谱、质粒构建图、序列比对文件。

cDNA文库构建

定义

含一种生物体所有基因编码的cDNA分子的克隆群。以mRNA为模板,经反转录酶催化,在体外反转录成cDNA,与适当的载体(常用噬菌体或质粒载体)连接后转化受体菌,则每个细菌含有一段cDNA,并能繁殖扩增,这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。

一般实验流程

1、反转录酶催化合成cDNA第一链

2、cDNA第二链的合成

3、cDNA的甲基化

4、接头或衔接子的连接

5、Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDNA

6、cDNA与λ噬菌体臂的连接

注意事项

1、RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法,盐酸胍—有机溶剂法,热酚法等等,提取方法的选择主要根据不同的样品而定)。

2、要构建一个高质量的 cDNA 文库,获得高质量的 mRNA 是至关重要的,所以处理 mRNA 样品时必须仔细小心。

3、由于 RNA 酶存在所有的生物中,并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境,因此建立一个无 RNA 酶的环境对于制备优质 RNA 很重要。

4、文库构建要选择合适的载体,常规用的是 λ 噬菌体,这是因为 λ DNA两端具有由12个核苷酸的粘性末端,可用来构建柯斯质粒,这种质粒能容纳大片段的外源 DNA。

5、胶回收前电泳槽,电泳板,梳子等都要用1%的HCl浸泡过夜。

6、胶回收时电压要稳定。

服务说明

1、请提供组织(100~200mg)、细胞(>106)、总RNA(>1μg)。

2、为保证后续文库构建能及时完成,请提供两次以上的样品需求量。

3、请务必保持样品新鲜,RNA无降解。

4、植物材料应尽量选取幼嫩部位,避免过老的组织。

5、请尽量提供物种基因组背景资料信息,如:基因组大小,基因平均长度,预计表达的基因数量等。

终产品

1、文库连接液,保存在-20℃

2、实验报告:文库评价数据(库容量,插入片段平均长度,重组效率,cDNA完整性评价,冗余度评价)、实验流程、产物电泳图谱及均一化前后管家基因对比图

ABOUT US

武汉中敏泰克生物科技有限公司是一家专业从事过敏性疾病诊断及预防产品的研发、生产和销售的高科技生物制药企业。

ADDRESS

湖北省武汉市东湖新技术开发区
高新大道666号武汉生物技术研究院B8栋

CONTACTS

P: 400 - 8049 - 899 ; 027-65022780

E: chinallergy@163.com